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PCR儀操作使用說(shuō)明：

（一）試劑PCR儀

1.引物：決定擴(kuò)增的特異性。根據(jù)檢測(cè)的DNA不同，選用不同引物，每種病原微生物都有自己特異的引物。

2.耐熱的DNA聚合酶：此酶是從耐熱細(xì)菌中分離出來(lái)的，能耐受高溫90℃-100℃。

3.10×PCR緩沖液：500mmol/l KCl;100mmol/L Tris-HCl（pH8.4,20℃）150mmol/L MgCl2,1mg/ml明膠。10×PCR緩沖液隨酶一起購(gòu)買。

4.5mmol/L dNTP貯備液：將dATP、dCTP、dGTP和dTTP鈉鹽各100mg合并，加入滅菌去離子水溶解，用NaOH調(diào)pH至中性，分裝每份300μl，-20℃保存。dNTP濃度用UV吸收法測(cè)定。現(xiàn)用dNTP溶液均有商品化產(chǎn)品。

5.DNA模板：用處理液將待測(cè)標(biāo)本處理，不同處理方法、操作各異，但目的是暴露標(biāo)本中被檢測(cè)的DNA。

（二）操作程序PCR儀

過(guò)去標(biāo)準(zhǔn)的PCR操作程序是將PCR儀必需反應(yīng)成份分別加入一微量離心管中，然后置于一定的循環(huán)參數(shù)條件下進(jìn)行循環(huán)擴(kuò)增。具體如下：

1.向一微量離心管中依次加入

DNA模板             102-105拷貝

引物                各1μmol/L

dNTP                各200μmol/L

10×PCR緩沖液       1/10體積

ddH2O               補(bǔ)到終體積（終體積50μl-100μl）

混勻后，離心15s使反應(yīng)成分集于管底。以上步驟僅在實(shí)驗(yàn)研究用，現(xiàn)在商品化試劑已將dNTP、10×PCR緩沖液，引物，ddH2O混合在一起，反應(yīng)體積為20-25μl，只要試驗(yàn)人員加入處理好的樣品就可以了。

2.加石蠟油50-100μl于反應(yīng)液表面以防蒸發(fā)。置反應(yīng)管于97℃變性10min。

3.冷至延伸溫度時(shí)，加入1-5u Taq DNA聚合酶，離心30s使酶和反應(yīng)液充分混合。現(xiàn)在臨床使用試劑酶通常已加入反應(yīng)液中。

4.PCR儀的循環(huán)程序?yàn)椋?4℃變性30s，55℃退火20s，然后在72℃延伸30s，共循環(huán)30-35次。較為后一次循環(huán)結(jié)束后，再將反應(yīng)管置72℃溫育5min，以確保充分延伸。

PCR儀尚可用于組織標(biāo)本DNA的擴(kuò)增。由于固定組織標(biāo)本的DNA常發(fā)生降解，就給常用的分析方法如Southern轉(zhuǎn)印雜交等帶來(lái)一定困難。

在應(yīng)用PCR方法檢測(cè)RNA病毒時(shí)，首先應(yīng)將RNA轉(zhuǎn)化成cDNA才能進(jìn)行擴(kuò)增，因?yàn)镻CR只能對(duì)DNA模板進(jìn)行擴(kuò)增，我們把這種RNA的PCR反應(yīng)稱為反轉(zhuǎn)錄PCR，簡(jiǎn)稱RT-PCR。把由RNA轉(zhuǎn)化成DNA的過(guò)程叫做反轉(zhuǎn)錄，反轉(zhuǎn)錄需要在反轉(zhuǎn)錄酶的作用下完成。

PCR儀使用注意事項(xiàng)：

1. PCR基因擴(kuò)增儀應(yīng)放置在水平堅(jiān)固的平臺(tái)上，外界電源系統(tǒng)電壓要匹配，并要求有良好的接地線。

2.環(huán)境溫度保持在23℃左右，濕度保持在60％左右。

3.應(yīng)配備功率≥3000W的穩(wěn)壓器。

4.應(yīng)定期清潔維護(hù)。

5.使用時(shí)應(yīng)嚴(yán)格遵守上述使用步驟。

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