Nanodrop是實(shí)驗室中常見的分光光度計。與傳統(tǒng)需要比色皿的分光光度計相比，Nanodrop所需樣品的體積大大減少，只需要2 μL，同時也大大降低了實(shí)驗準(zhǔn)備以及清洗的時間。這些優(yōu)勢使得科研人員能夠在一分鐘內(nèi)檢測多個樣品。當(dāng)然如果你有更多的樣品，還嫌效率不夠高，你可以選擇應(yīng)用Nanodrop 8000系統(tǒng)，它能夠同時檢測8個樣品。
Nanodrop能夠在包括紫外及可見光區(qū)域在內(nèi)的光譜范圍內(nèi)檢測樣品的吸光度信號。在實(shí)驗開始前，需要在儀器的軟件內(nèi)設(shè)置檢測樣品的種類，包括蛋白質(zhì)，DNA, RNA等。根據(jù)吸光度,能夠計算樣品的濃度。DNA及RNA 在260 nm處有大吸收度，蛋白質(zhì)在280 nm處有大吸收峰值。濃度與吸光度的對應(yīng)關(guān)系見下表。當(dāng)然表中濃度與吸光度對應(yīng)關(guān)系成立的前提是樣品必須具有很高的純度。樣品純度可以通過A260/280判定，其臨界值可參考下表。 大家可能注意到，RNA的A260/280比值要比DNA的值高一些，這是因為堿基U的A260/280的比值要比堿基T的A260/280比值更高。
吸光度 | 樣品 | 樣品濃度 | 高純度樣品標(biāo)準(zhǔn)（A260/280 ） |
A260 =1 | 雙鏈DNA | 50 μg/ml | <1.8 |
單鏈DNA | 33 μg/ml | ||
單鏈RNA | 40 μg/ml | >2.0 | |
A280 = 1 | 蛋白質(zhì) | 1 mg/ml | <0.6 |
對Nanodrop檢測結(jié)果產(chǎn)生直接影響的因素就是樣品的純度。A260/280是檢測樣品純度的一個指標(biāo)，但這個參數(shù)只衡量了蛋白質(zhì)與核酸之間相互污染的情況。沒有考慮DNA與RNA之間彼此污染以及其他物質(zhì)污染的情況，比如苯酚在270 nm附近具有較大的吸光值。
因此在利用Nanodrop檢測核酸濃度的時候，除了A260/280外，A260/230也是檢測樣品純度的一個指標(biāo)，高純度DNA和RNA的兩個臨界值同樣是1.8以及2.0。A260/230在2.0-2.2之間是合理的數(shù)值。對于純的核酸，A260/230的值通常大于A260/280的值。核酸提取過程中殘留的有機(jī)物通常會對檢測結(jié)果產(chǎn)生影響。如果檢測結(jié)果顯示230nm處具有很大的吸光值，樣品很有可能被EDTA，碳水化合物或者硫氰酸胍等物質(zhì)污染了。
Nanodrop的檢測范圍。對于核酸來說，Nanodrop的檢測濃度范圍在2ng-15μg/μL之間。所以當(dāng)樣品的濃度很低時，比如從單個或少量細(xì)胞中提取的DNA或RNA，利用Nanodrop來測量濃度可能就不適合了。這時需要考慮其他的核酸定量方法比如熒光染料的方法。
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